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細胞增殖與毒性檢測(CCK8 法)
  • 更新日期:2023-04-04      瀏覽次數:2238
    • 一、實驗目的
      通過檢測細胞活力來驗證目的基因對細胞增殖的影響,或驗證某種藥物對細胞的毒性。

      二、實驗原理
      Cell Counting Kit-8(簡稱 CCK8) 
      試劑中含有 WST-8?;罴毎貏e是增殖期細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能夠使 WST-8 還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比,用酶標儀在 450nm 波長處測定其吸收值,即可間接反映細胞增殖情況。

      三、實驗步驟
      1. 將細胞以 104-105 個細胞/孔的密度接種在  96 孔板中,加入 100μL 
      培養基,含或不含待測化合物。在 CO2 培養箱中在 37℃ 下培養細胞 24 小時。
      2. 向板中加入 10μL 不同濃度的待測物質。
      3. 在培養箱中將培養板培養適當時間(如 6、12、24 或 48 小時)。
      4. 向板的每個孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要將氣泡引入孔中。
      5. 將平板在培養箱中孵育 1-4 小時。
      6. 在讀板之前,在定軌振蕩器上輕輕混勻。
      7. 使用酶標儀測量 450nm 處的吸光度。

      四、常見問題及解答
      Q1:做細胞活性檢測時,每孔應該接種多少個細胞?
      A:當使用標準 96 孔板時,貼壁細胞一般最小接種量為 1,000 個/孔 (100 μL 
      培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于 2,500 個/孔 (100 μL 培養基),當然,也有部分極其靈敏的試劑盒或可檢測更少量的細胞。

      Q2:若是使用 6 孔或者 24 孔板進行試驗,CCK 試劑使用量怎么樣呢?
      A:如果要使用 6 孔板或 24 孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養基總體積的 10% 加入 CCK8 溶液。

      Q3:培養基的本底顏色如酚紅會不會影響細胞活性的檢測呢?
      A:不會的,培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光值而消去,因此不會對檢測造成影響。

      Q4:只可以在 450nm 波長處測 OD 值嗎?
      A:可以在 450nm 波長處測 OD 值,但是若無此波長的濾光片,可選擇吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片,但是 450 nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

      Q5:若是暫不檢測 OD 值,該如何處理?
      A:若暫時不測定 OD 值,可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的 HCL 溶液或者 1% w/v 
      SDS 溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24 小時內測定,吸光度不會發生變化。

      Q6:在實驗中 OD 值太高,怎么解決?
      A:CCK-8 試劑后的培養時間由 2 小時縮短為 1 小時。此外,可適當減少細胞的數量。

      Q7:應該每次做標準曲線嗎?
      A:建議每次做。雖然細胞是一樣的,但是細胞的狀態不一定一樣。對于狀態不一樣的細胞,建議每次做標準曲線。

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